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Scala di efficienza per la diffusione di particelle luminescenti legata a proprietà spettroscopiche fondamentali e misurabili

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Jul 17, 2023

Scala di efficienza per la diffusione di particelle luminescenti legata a proprietà spettroscopiche fondamentali e misurabili

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 6254 (2023) Cita questo articolo 514 Accessi Dettagli metriche Confronto delle prestazioni di luminofori molecolari e su scala nanometrica e micro- e luminescenti

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 6254 (2023) Citare questo articolo

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Il confronto delle prestazioni dei luminofori molecolari e su scala nanometrica e delle micro e nanoparticelle luminescenti e la stima delle ampiezze del segnale ottenibili e dei limiti di rilevamento richiedono una scala di intensità standardizzabile. Ciò ha avviato lo sviluppo delle relative scale MESF (numero di molecole di fluorocromi solubili equivalenti) ed ERF (fluorofori di riferimento equivalenti) per la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza. Entrambe le scale di intensità si basano sui valori di intensità di fluorescenza assegnati alle sfere di calibrazione fluorescenti mediante un confronto di intensità con soluzioni di fluoroforo spettralmente molto simili di concentrazione nota utilizzando uno spettrofluorimetro. In alternativa, è possibile determinare la luminosità del luminoforo o della perla (B) che è uguale al prodotto della sezione trasversale di assorbimento (σa) alla lunghezza d'onda di eccitazione (σa(λex)) e alla resa quantica della fotoluminescenza (Φpl). In tal modo, è possibile realizzare una scala assoluta basata su proprietà spettroscopiche fondamentali e misurabili che è indipendente dalla dimensione delle particelle, dal materiale e dalla densità di colorazione o etichettatura dei luminofori e considera la sensibilità delle proprietà ottiche dei luminofori al loro ambiente. Con l'obiettivo di stabilire una tale scala di luminosità per le dispersioni di diffusione della luce di particelle luminescenti con dimensioni superiori a poche decine di nanometri, dimostriamo come la luminosità di particelle di polistirene (PSP) quasi monodisperse di dimensioni 25 nm, 100 nm e 1 µm, caricate con due coloranti diversi in concentrazioni variabili, possono essere ottenuti con un'unica configurazione di sfera integratrice progettata su misura che consente la determinazione assoluta di Φpl e misurazioni di trasmittanza e riflettanza diffusa. I risultanti Φpl, σa(λex), le parti immaginarie dell'indice di rifrazione e i valori B calcolati di questi campioni vengono forniti in dipendenza del numero di molecole di colorante incorporate per particella. Infine, viene definita un'efficienza di luminescenza (LE) senza unità consentendo il confronto diretto delle efficienze di luminescenza di particelle di dimensioni diverse.

Negli ultimi decenni, nanoparticelle (NP) e microparticelle (MP), colorate o codificate con diversi tipi di luminofori molecolari e nanocristallini, sono state sempre più utilizzate nelle scienze della vita e dei materiali. Le applicazioni tipiche spaziano dai reporter ottici per test di fluorescenza e sistemi di bioimaging e di somministrazione di farmaci, oltre a tag di autenticazione stampabili e piattaforme basate su microsfere per citometria a flusso, microscopia a fluorescenza e immunoseparazione, fino a sensori di particelle e strumenti di calibrazione per diversi metodi di fluorescenza, in particolare per citometria a flusso1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. La maggior parte dei metodi di fluorescenza che sfruttano NP e MP emissive come la spettroscopia di fluorescenza, la microfluorometria, la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso misurano solo le intensità di fluorescenza relative specifiche dello strumento14. Il confronto affidabile delle misurazioni della fluorescenza tra diversi strumenti e diversi laboratori richiede una calibrazione dello strumento per determinare e considerare i contributi del segnale specifico dello strumento come la reattività spettrale dipendente dalla lunghezza d'onda del canale di rilevamento dello strumento, che influenza gli spettri di emissione misurati15,16. Per la quantificazione, ad esempio, di analiti o il confronto di diversi campioni fluorescenti con diverse tecniche di fluorescenza, comunemente viene eseguita una calibrazione relativa della scala di intensità della fluorescenza utilizzando soluzioni fluoroforiche con concentrazioni note, proprietà di luminescenza e in particolare spettri di emissione che si avvicinano strettamente a quelli del campione utilizzando le stesse impostazioni dello strumento applicate per la misurazione del campione17. Ciò è semplice per campioni luminescenti trasparenti, ad esempio applicazioni di rilevamento o quantificazione di luminofori con tecniche di separazione cromatografica come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con rilevamento di fluorescenza, ma è impegnativo per i sistemi di diffusione della luce. Tuttavia, la maggior parte delle dispersioni di NP e MP fluorescenti ampiamente utilizzate diffondono la luce di eccitazione, a seconda delle loro dimensioni, dell'indice di rifrazione e dell'ambiente delle particelle. Ciò può influenzare la loro caratterizzazione fluorimetrica e in particolare le misurazioni delle loro caratteristiche di assorbimento con i comuni spettrofotometri e spettrofluorimetri progettati per la misurazione di campioni trasparenti.

 0). The normalized absorbance and emission spectra of aqueous dispersions of these differently sized PSP loaded with Nile Red and Itrybe are displayed in the SI in Fig. S5. Due to the dye staining of the particles via a previously optimized swelling procedure assessed, e.g., microscopy, the dye molecules can be assumed to be homogeneously distributed within the particles, and the spherical shape of the particles is preserved in the process.12,41,42,44 This allows for a data analysis based on Mie Theory, like with the unstained particles discussed above. The absorbance and emission spectra of Itrybe-loaded PSP are broadened compared to the parent molecule in ethanol, yet the respective absorption and emission maxima match. In the case of solvatochromic Nile Red, the absorbance and emission bands of Nile Red-stained PSP are red shifted with decreasing PSP size, pointing to an increasingly polar microenvironment faced by the dye molecules with reduced PSP size and hence increased surface-to-volume ratio. The corresponding \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of aqueous dispersions of Nile Red- and Itrybe-loaded PSPs in dependence on PSP size and loading concentration, i.e., the average dye-dye distance are shown in Fig. 4. This figure reveals opposite trends for the particle size- and dye loading-dependent \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of both dyes. As shown in the left panel of Fig. 4, the \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) values of Nile Red-stained PSP decreased with decreasing PSP size and increased surface-to-volume ratio. In contrast, for PSP containing Itrybe molecules, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) decreased with increasing particle size (right panel of Fig. 4. For both dyes, an increase in dye loading concentration resulted in a diminution of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (see also SI, Fig. S7). We attribute these trends to (1) the influence of the polar particle environment particularly in the case of the charge transfer dye Nile Red, the fluorescence of which is known to be quenched by hydrogen bonding interactions and polarity as follows also from the solvatochromic emission behavior of Nile Red (see SI, Fig. S5), (2) dye-dye interactions, and (3) energy transfer processes between dye molecules in the PSP. The latter two factors are supported by the dependence of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) on dye loading concentration (see Fig. 4 and SI, Fig. S7)66,67,68,69,70. µa(λ) and µs(λ) of the dispersed 1 µm and 100 nm dye loaded PSPs determined by radiation transport and Mie Theory are shown in Fig. 5. For the 25 nm sized particles the scattering contributions were too small to be used for quantification and represent the physical size limit for our study and method development. For the fit of µa(λ) and µs(λ), we considered the contribution of the dye molecules to the dielectric function of the particle matrix by increasing the imaginary part of the refractive index. In a first step, n2 was used as a free variable and it was assumed that the particle matrix is homogeneously loaded with dye molecules. The resulting σa(λ) values are shown in Fig. 6. The resulting Np and rp values were also used for the determination of σa(λ) from µa(λ) calculated from the radiation transport theory. For the particle sizes and dye concentrations used here, the direct determination of σa(λ) from Mie calculations and calculations using radiation transport theory are in good agreement as displayed in Fig. 5./p>

3.0.co;2-i" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819960315%2926%3A1%3C22%3A%3Aaid-cyto4%3E3.0.co%3B2-i" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:13.0.co;2-i"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

3.0.CO;2-X" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C213%3A%3AAID-CYTO16%3E3.0.CO%3B2-X" aria-label="Article reference 22" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:23.0.CO;2-X"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

3.0.co;2-q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C188%3A%3Aaid-cyto13%3E3.0.co%3B2-q" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:23.0.co;2-q"Article CAS PubMed Google Scholar /p>